helikoptery w akcji

Wszystkie linie komórkowe zostały wybrane i użyte jako populacje połączone. Uzyskanie klonów limfocytów T z ograniczoną ekspresją CD1d. Klony limfocytów T z ograniczonym CD1d uzyskano przez barwienie ludzkich PBMC ludzkimi tetramerami CD1d obciążonymi a-GalCer, jak opisano wcześniej (57). Pozytywnie wybarwione komórki T były pojedynczymi komórkami sortowanymi za pomocą cytometrii przepływowej i hodowano je w obecności napromieniowanych alogenicznych ludzkich PBMC w pożywce hodowlanej RPMI zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 1% ludzkiej surowicy AB, 1% penicyliny w połączeniu ze streptomycyną (Invitrogen Corp.), 2 mM L-glutaminy (Invitrogen Corp.), x PHA i 2 nM IL-2. Sklonowane linie komórek T ekspandowano w hodowli, stosując tę samą pożywkę, ale pozbawioną PHA i powtarzano ją okresowo przez ekspozycję na napromieniowane alogeniczne PBMC w obecności PHA. Testy uwalniania kokultury i IFN. Zaprojektowano kultury z 104 komórkami docelowymi i ostatnio stymulowano limfocyty T z ograniczeniem CD1d w stosunku docelowym do efektora 1: lub 1: 2. Komórki te hodowano wspólnie w 96-dołkowych płytkach przez 18 godzin w 37 ° C, po czym supernatanty usunięto i poziomy IFN-y zostały przeanalizowane. D -OsolCER rozpuszczony w DMSO utrzymywano w temperaturze 4 ° C w stężeniu 100 .g / ml. Został poddany działaniu ultradźwięków w temperaturze 37 ° C w sonikatorze z kąpielą wodną przed użyciem w stężeniu 50 ng / ml. Ilościowe oznaczanie IFN-y wytwarzanie określono przez uśrednienie potrójnych studzienek i zastosowanie regresji liniowej z krzywej standardowej i oznaczono za pomocą standardowego testu ELISA przy użyciu zestawu BD Biosciences OptEIA. Konstrukcja chimerycznych wektorów ekspresyjnych CD1d. Mouse CD1d (nr katalogowy 948632 VK35G05R ., American Type Culture Collection) amplifikowano PCR z użyciem następujących primerów: do przodu, 5 (3-GTACTGGATCCGCCGCCACCATGCGGTACCTACCATGGCTGTT-3; odwrotna, 5a-TGCATGCGGCCGCTCACCGGATGTCTTGATAAGCGCTTCTCCTTCTCCAGATATAGTAGACTACAGCACCC-3 .; przy użyciu PfuUltra (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Fragment sklonowano w miejscach BamHI i Notl pCR3.1 (BD Biosciences. Clontech). Ludzki CD1d (kolekcja genów ssaków nr 34622, numer obrazu 5229534) poddano amplifikacji PCR z użyciem następujących starterów: do przodu, 5 (3 -ATCATGGATCCGCCGCCACCATGGGGGTGCCTGCTGTTTCTGCTG-3y; odwrotna (typu dzikiego), 5a-TATATGCGGCCGCTCACAGGACGCCCTGATAGGAAGTT-3 .; odwrotna (mutant lizyna-arginina), 5a-TATATGCGGCCGCCACAGGACGCCCTGATAGGAAGTTTGCCTGCGAAACCGGGAGGTAAAGCCACACAATGAGG-3 .. Wszystkie produkty odzyskano i wklonowano w miejsca BamHI i Notl pCR3.1 (BD Biosciences. Clontech). Chimeryczne CD1d wytworzono przez wytworzenie fragmentów zewnątrzkomórkowej domeny mysiego CD1d za pomocą startera myszy CD1d przedniego i startera wstecznego 5. -CAGGACTGCCAAGGCAATCAAGCCCATGGGTGCTTGCCTGGCATCCC-3. i transbłonowego i cytoplazmatycznego ogonka ludzkiego CD1d z odwrotnymi starterami dla ludzkiego CD1d (mutanta typu dzikiego lub lizyny na argininę) i przedniego startera 5a-GGGATGCCAGGCAAGCACCCATGGGCTTGATTGCCTTGGCAGTCCTG-3. z PfuUltra (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Fragmenty oczyszczono na żelu i zmieszano w pojedynczej reakcji PCR z przednim starterem dla pełnej długości mysiej CD1d i startera do tyłu dla pełnej długości ludzkiego CD1d (mutant typu dzikiego lub lizyny na argininę) przy użyciu polimerazy DNA Vent (New England) Biolabs) zgodnie z instrukcjami producenta. Chimeryczne fragmenty odzyskano i wklonowano do miejsc BamHI i Notl w pCR3.1 w celu przeprowadzenia badań ekspresji lub subklonowano do pMX-PIE (dar od M. Lodoena i LL Laniera, UCSF, San Francisco, Kalifornia, USA) w celu utworzenia retrowirusów. dla stabilnej transdukcji. Cytometrii przepływowej. Komórki BCBL-1 utrwalono w 4% paraformaldehydzie i przemyto 3 razy PBS. Komórki następnie zablokowano przez przemycie PBS plus 1% BSA. Komórki BCBL-1 inkubowano następnie z króliczym anty-K8.1 w 100 ul PBS plus 1% BSA przez 45 minut na lodzie, przemywano PBS plus 1% BSA, inkubowano z mysim antybiotykiem skoniugowanym z FITC (Sigma). Aldrich) w 100 ul PBS plus 1% BSA i przemyto PBS plus 1% BSA
[przypisy: olx ostrowiec sw, napięciowe bóle głowy, mielopatia szyjna ]