herbata z rumiankiem

Mieszanina reakcyjna składała się z Universal Master Mix No AmpErase UNG (Applied Biosystems), 0,25 .m fluorogennej sondy, 0,9 .M każdego specyficznego startera do przodu i do tyłu i 9 .l rozcieńczonego cDNA (co odpowiada około 90 ng całkowitego RNA). Amplifikacje przeprowadzono w standardowych warunkach. Liczbę cykli PCR potrzebnych do osiągnięcia progu fluorescencji określono w dwóch powtórzeniach dla każdego cDNA, uśredniono, a następnie znormalizowano do co najmniej genu referencyjnego (18S, GAPDH lub białka wiążącego TATA [TBP]; patrz Dodatkowa Figura 4 dla dalszego szczegóły), aby uzyskać numer cyklu, w którym osiągnięto próg fluorescencji (Ct). Stosunek ekspresji w starych i młodych tkankach (stary / młody) określono jako 2 [Ct (stare). Ct (młody)]; zatem log2 (stary / młody) = Ct (stary). Ct (młody). W celu obliczenia współczynników korelacji SE i Pearsona za pomocą oprogramowania Prism (GraphPad Software Inc.) współczynniki zostały przekształcone w log. W celu bezwzględnej kwantyfikacji liczby kopii transkryptu dla p16INK4a, p15INK4b, p19ARF, p21CIP, p18INK4c i p19INK4d, interesujący fragment został sklonowany i uzyskano krzywą standardową z seryjnymi 4-krotnymi rozcieńczeniami (dodatkowa Figura 5). Dla wszystkich testowanych testów, reakcja PCR była liniowa w badanym zakresie (19. 40 cykli amplifikacji, Supplemental Figure 5). Jeśli Ct nie został osiągnięty przez 40 cykli, ekspresję uznano poniżej granicy wykrywalności. Wszystkie reakcje RT-PCR dały pojedyncze pasmo analizowane za pomocą elektroforezy żelowej, a wszystkie reakcje wykorzystywały wewnętrzną sondę znakowaną fluorochromem w celu zwiększenia czułości i swoistości. Sortowanie komórek szpiku kostnego, węzła chłonnego, grasicy i śledziony. Tkanki myszy w wieku 5- i 22-miesięcznym (n = 2 na wiek) zostały zdezagregowane i posortowane. W przypadku szpiku kostnego, frakcje o ujemnym rodowodzie i linie dodatnie zebrano przy użyciu zestawu do deplecji komórek linii z separatorem autoMACS (Miltenyi Biotec Inc.) zgodnie z protokołem producenta. Składniki zrębowe i komórkowe dla węzłów chłonnych, grasicy i śledziony przygotowywano przez prasowanie pomiędzy oszronionymi szkiełkami, a następnie przemywanie PBS zawierającym 10% FCS. Splenocyty następnie analizowano dalej po lizie czerwonych krwinek przez barwienie przeciwciałami mAb anty-B220 (Caltag Laboratories Inc.) i anty-CDllb (Mac1; Caltag Laboratories Inc.) przez 30 minut na lodzie, a następnie płukanie. Komórki sortowano według MoFlo (Cytomation Inc.) do B220 +, Mac1 + i B220 . Mac1. populacje (czystość> 94%) w ośrodku FACS Core Uniwersytetu Północnej Karoliny. Barwienie IHC i SA-a-gal. Aby określić optymalne warunki barwienia IHC dla p16INK4a, tkanki zebrano z dobranego pod względem wieku ściółki p16INK4a + / + i p16INK4a. /. myszy i analizowane. Po empirycznych testach kilku utrwalaczy, jak opisano wcześniej (62), ustalono, że roztwór alkoholu etylowego Fekete (61% ETOH, 4,3% lodowatego kwasu octowego i 3,5% formaliny) jest optymalny do barwienia IHC p16 INK4a w tkankach myszy i szczura przy użyciu dostępne w handlu przeciwciało i zestaw (zestaw HRP ImmunoCruz z przeciwciałem F-12, sc-1661, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Pięć mikronowych wycinków parafiny pocięto i poddano odzyskowi antygenów cytrynianu parowego, hybrydyzację według protokołów producenta i barwienie kontrastowe hematoksyliną. Sekcje były badane przez obserwatora ślepego na wiek zwierzęcy, dietę i genotyp. Barwienie SA-y-gal przeprowadzono jak opisano uprzednio (15, 39, 43). W skrócie, cienkie skrawki (<2 mm) zebranych narządów utrwalono w temperaturze pokojowej przez 15 minut w 0,5% aldehydem glutarowym / PBS (pH 6,0). Po utrwaleniu plasterki narządów przemyto dwukrotnie PBS (pH 6,0), wybarwiono na noc w 37 ° C w buforze SA-P-gal (1 mg / ml X-gal, 5 mM żelazicyjanku potasu, 5 mM żelazocyjanku potasu i mM MgCl2 w PBS, pH 6,0) i sfotografowano za pomocą kamery CCD o wysokiej rozdzielczości (LighTools Research). Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Chcemy podziękować Johnowi Kopchickowi, Nancy Nadon, Igorowi Mikaelianowi, Richardowi Falvo, Scottowi Alsonowi, Balfour Sartorowi i Yue Xiongowi za porady i odczynniki; oraz Andrzej Bartke, Diego Castrillon i Ron DePinho za komentarze do rękopisu Praca ta została wsparta grantami z Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research, programu Paul Beeson Physician Scholars oraz NIH (AG19899 i CA090679). Przypisy Patrz odnośny komentarz od strony 1237. Użyte niestandardowe skróty: AL, ad libitum. Fed; CDKI, inhibitor kinazy zależnej od cyklin; CR, ograniczenie kaloryczne, ograniczone kalorycznie; F344, Fischer 344; GHR, receptor hormonu wzrostu; IHC, immunohistochemia; stary / młody, ekspresja RNA w starych i młodych tkankach; PcG, grupa Polycomb; SA - y - gal, związana z senescencją a-galaktozydaza. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [hasła pokrewne: ciosmy, malwa czarna, młody zielony jęczmień gdzie kupić ]