irygacja zatok przynosowych

Zbadaliśmy również wpływ przeciwciał anty-CD1d na aktywację. Jak pokazano na Figurze 3C, zmniejszona aktywacja anty-CD1d przez kontrolne komórki BJAB / lacZ w stopniu podobnym do tego powodowanego przez ekspresję MIR2. Dodanie anty-CD1d do komórek BJAB / MIR2 w teście dodatkowo zmniejszyło poziom aktywacji widziany w tym kontekście, wskazując na obecność niskiego poziomu resztkowego CD1d na powierzchni tych komórek. Zatem ekspresja MIR2 znacznie zmniejsza, ale nie całkowicie eliminuje resztkową sygnalizację zależną od CD1d. Figura 3 Obniżenie poziomu MIR2 CD1d obniża aktywację limfocytów T z ograniczeniem CD1d. (A) Komórki BJAB stabilnie transdukowano lacZ (szare słupki) jako kontrolę lub MIR2 (białe słupki) hodowano wspólnie z limfocytami T z ograniczeniem CD1d. Tę hodowlę przeprowadzono w obecności y-GalCer w celu zapewnienia aktywującego ligandu dla limfocytów T. Każdą hodowlę przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Po 18 godzinach hodowli, każdy supernatant testowano na IFN-y. uwalnianie przez ELISA. (B) Tak jak w A, eksperymenty hodowlane przeprowadzono z limfocytami T z ograniczeniem CD1d i komórkami BJAB, tym razem w obecności lub nieobecności a-GalCer. Kokultury prowadzono za pomocą. -GalCer lacZ (jasnoszare słupki), (3-GalCer MIR2 (białe słupki), lacZ bez a-GalCer (czarne słupki) i MIR2 bez. -GalCer (ciemnoszare słupki). Po 18 godzinach supernatanty odzyskano, a IFN-y. w każdym supernatancie oznaczano testem ELISA. (C) Tak jak w A, eksperymenty z hodowlą przeprowadzano z limfocytami T z ograniczeniem CD1d i komórkami BJAB, albo w obecności mysiej anty-MHC klasy I jako kontroli (lacZ, ciemnoszare słupki, MIR2, białe słupki) lub mysiego antygenu. -CD1d (lacZ, czarne kreski, MIR2, jasnoszare słupki). Po 18 godzinach supernatanty odzyskano, a IFN-y. w każdym supernatancie oznaczano testem ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnie. SD. MIR2 indukuje ubikwitynację i internalizację białek związanych z CD1d i / lub CD1d. We wcześniejszych badaniach nad regulacją MIR w dół MHC klasy I i B7.2, my (32) i inni (38) wykazali, że regulacja w dół docelowych białek zależy od ubikwitynacji cytosolowych reszt lizyny w celu. Wszechobecność wyzwala internalizację tych łańcuchów i kieruje powstający endosom na szlak wielopęcherzykowego ciała (MVB) (39), gdzie jego zawartość jest sortowana do lizosomów i rozkładana przez proteazy lizosomalne (28, 32). Chociaż nie wszystkie etapy związane z tą ścieżką sortowania są w pełni zrozumiałe, wiadomo, że ubikwityna odgrywa również ważną rolę w tych procesach. Na przykład wiele komponentów maszyny MVB jest albo ubikwitynowanych, albo zawiera motywy wiążące się z ubikwityną (patrz odnośnik 40). Biorąc pod uwagę znaczenie ubikwitynacji w aktywności MIR, zapytaliśmy, czy CD1d lub związane z nim łańcuchy ulegają ubikwitynianacji w sposób zależny od MIR. Komórki HepG2 stabilnie transdukowane lacZ lub MIR2 poddano lizie w detergencie; CD1d poddano immunoprecypitacji, rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na stałe nośniki i poddano immunoblottingu za pomocą antybiikwityny sprzężonej z HRP. Jak pokazano na fig. 4, immunoprecypitacja za pomocą CD1d indukuje silny i heterogenny sygnał ubikwitynacji tylko w komórkach z ekspresją MIR2, a nie w komórkach kontrolnych wyrażających lacZ. Ponieważ wykazano, że ludzka CD1d tworzy stabilne kompleksy z innymi białkami (tj. MHC klasy II) (37), ubikwitynowane prążki na Figurze 4 mogą reprezentować wielokrotnie ubikwitynowane łańcuchy CD1d, ubikwitynację wielu powiązanych białek lub oba. Figura 4 Ekspresja MIR2 prowadzi do koimmunoprecypitacji ubikwitynowanych białek za pomocą CD1d. Komórki HepG2 stabilnie transdukowane lacZ lub MIR2 zostały poddane lizie, a ludzki CD1d (hCD1d) został immunoprecypitowany z lizatów. Immunoprecypitat następnie rozdzielono za pomocą SDS-PAGE i przeniesiono na nitrocelulozę, a obecność ubikwitynowanych białek określono metodą Western blot z przeciwciałem anty-ubikwitynowym skoniugowanym z HRP (Anti. Ub-HRP).
[hasła pokrewne: łupież tłusty, mastocytoza, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów ]