kardiolog dziecięcy wrocław kamieńskiego 225

Sondowanie dla (3-aktyny oceniało równe obciążenie białek na żelu. RT: odwrotna transkryptaza; WT: typu dzikiego; Na, K: Na, K-ATPase-P 1. Aby ocenić, czy te zmiany w transkrypcji genów są równoległe poprzez zmiany w ekspresji białka, lizat z całych komórek zebrano 24 godziny po transfekcji i poddano Western blotting. Wektor pSV-lacZ zastosowano do pomiaru wydajności transfekcji. Nadekspresja DN p53 spowodowała zależną od dawki regulację w dół poziomów białka endogennego B2R, AT1A i Na, K-ATPazy-A (Figura 4, cpi). Łącznie wyniki te sugerują, że komórkowy p53 reguluje ekspresję RFG w warunkach fizjologicznych. W celu określenia, czy aktywacja promotora za pośrednictwem p53 zależy od specyficznego dla sekwencji wiązania DNA, miejsca wiązania p53 w promotorach B2R i Na, K-ATPase-A usunięto stosując podejście ukierunkowanej mutagenezy. Jak pokazano na Figurze 5 (u góry), delecja miejsca wiążącego p53 w pozycji nukleotydowej od A50 do . 69 w szczurzym promotorze B2R zniosła transaktywację zależną od p53. Skrócenie promotora Na, K-ATPazy-A ((6,0 kb / konstrukt CAT) do około 1,4 kb powyżej miejsca startu transkrypcji nie wpłynęło na reakcję promotora na p53. Jednakże, delecja motywu wiążącego p53 w pozycji nukleotydowej od 159 do 1778 istotnie hamowała aktywację, w której pośredniczy p53, o około 50% (Figura 5, dół). Aktywność resztkowa prawdopodobnie zależy od wiązania p53 z dodatkowymi niezidentyfikowanymi miejscami wiązania p53, ponieważ mutant p53 wiążący DNA nie jest w stanie aktywować tego promotora (dane nie przedstawione). Figura 5Drugowanie miejsc wiązania p53 w promotorach RFG hamuje aktywację, w której pośredniczy p53. Komórki UB transfekowano 50 ng pCMV-p53 i konstruktami promotora-reportera B2R lub Na, K-ATP-azy-a (po 1,2 | jg). Ekstrakty komórkowe zbierano 24 godziny po transfekcji i badano pod kątem aktywności CAT. Wyniki są wyrażone jako różnica krotności i są średnie. SE trzech eksperymentów wykonanych w dwóch powtórzeniach. * P <0,001; # P <0,05. Ostatnie badania zidentyfikowały dwóch nowych członków rodziny genów p53, p63 i p73. Te trzy białka mają wspólne geny docelowe. Oceniliśmy, czy p73 ma jakikolwiek wpływ na aktywność promotora RFG. Wyrażanie ludzkiej lub małpy p73. w komórkach HeLa lub UB nie udało się transaktywować promotorów AQP-2 i Na, K-ATP-azy-a1 i skromnie aktywowanego B2R (podwójnie) w porównaniu z efektem leczenia p53, co zwiększyło 15-krotnie aktywność B2R. Wskazuje to, że RFG reagują selektywnie na p53 (dane nie pokazane). Wiązanie promotorów p53 do RFG. p53 aktywuje transkrypcję genu poprzez wiązanie z konsensusowym elementem DNA składającym się z dwóch kopii odwróconej sekwencji powtórzeń RRRC (A / T) (T / A) GYYY, oddzielonych nukleotydami 0. 13 (32, 33). Użyliśmy EMSA do zbadania, czy domniemane motywy p53 znajdujące się w promotorach RFG wiążą rekombinowane ludzkie ekstrakty jądrowe p53 lub pochodzące z nerki. Znakowane izotopowo oligodeksy, odpowiadające miejscom p53 w RFG, wytworzyły specyficzne kompleksy DNA-białko z p53, chociaż z różną intensywnością, w następującej kolejności: B2R> AT1A> szczurze AQP-2> mysie AQP-2> Na, K-ATPase-A. (Figura 6, a. C). Figura 6 Związanie rekombinowanych ekstraktów jądrowych p53 lub nerek z miejscami wiązania p53 w RFG. (a) EMSA pokazuje wiązanie rekombinowanego ludzkiego białka p53 o pełnej długości (500 ng dla B2R i 2 (ig dla AT1A i AQP-2) z oligodeksem znakowanym 32P, odpowiadającym motywom p53 w promotorach RFG. (b) EMSA wykazujące, że wiązanie się B2R p53 oligoduplex z ekstraktami jądrowymi pochodzącymi z nerki noworodków (N) jest znacznie wyższe niż w przypadku nerki dorosłej (A). Ścieżki 1, 4 i 7 zawierają ekstrakty jądrowe z kontrolnej (C) linii komórkowej SVT-2 p53-dodatniej
[więcej w: olx ostrowiec sw, narośl na skórze, misy tybetańskie ]