nordic walking poznań forum

We wszystkich przypadkach docelowe białka są ubikwitynowane i endocytozowane. W przypadku łańcuchów MHC klasy I, zwiększona endocytoza powoduje, że łańcuchy są dostarczane przez MVB do lizosomów w celu degradacji. Ponieważ etapy sortowania MVB również w znacznym stopniu obejmują białka ubik-bitynowane, zasugerowano, że MIR mogą mieć dodatkowe cele ubikwitynacyjne poniżej etapu endocytowego (39, 40). Jednak w przypadku CD1d, znaleźliśmy mało dowodów na zwiększone lizosomalne dostarczanie białka, pomimo jego skutecznej endocytozy pod wpływem białek MIR. To oddzielenie endocytozy za pośrednictwem ubikwityny i degradacja przez białka MIR wskazuje, że głównym etapem regulowanym przez MIR jest endocytoza. Być może różnica między CD1d i MHC klasy I odzwierciedla różne szlaki normalnie przyjmowane przez te białka. Mysie CD1d ma długi okres półtrwania i wiadomo, że jest aktywnie poddawany recyklingowi z wewnętrznych pęcherzyków do błony komórkowej; w rzeczywistości, w stanie ustalonym, znaczna część dopełniacza komórkowego białka znajduje się w wewnętrznych pęcherzykach (56). Sugeruje to, że degradacja lizosomalna odgrywa w najlepszym przypadku niewielką rolę w obrocie polipeptydów CD1d. Tak więc, w przypadku zarówno CD1d, jak i MHC klasy I, najprostszym wyjaśnieniem działania MIR jest to, że jest on bezpośrednio ukierunkowany na etap endocytowy. Kiedy białko jest naturalnie sortowane do degradujących lizosomów (np. MHC), powoduje to zwiększenie obrotu; kiedy białko może sortować do lizosomu i nie ulegać degradacji (np. CD1d), wynikiem jest zwiększona internalizacja. Dokładnie analizując dopełniacz ubikwitynowanych białek gospodarza, które kompleksują się z MHC klasy I i CD1d w obecności MIR2, mamy nadzieję, że będziemy w stanie przeanalizować szczegóły biochemiczne mechanizmu downregulacyjnego, a tym samym rzucić więcej światła na handel tymi ważnymi mediatorami rozpoznawanie immunologiczne. Metody Kultura komórkowa. BCBL-1, ustalona ludzka linia komórek B zakażona KSHV wolna od infekcji EBV, hodowano w RPMI z glutaminą, wodorowęglanem sodu i P-merkaptoetanolem (Invitrogen Corp.). HepG2, linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego, była hodowana na minimalnym podstawowym podłożu (Invitrogen Corp.). Phoenix, linia komórek retrowirusowych pakujących na bazie 293T, hodowano w DMEM, a linię komórkową chłoniaka z komórek B BABA hodowano w pożywce RPMI 1640. Wszystkie pożywki dodatkowo suplementowano 10% (obj./obj.) Płodową surowicą cielęcą, jak również połączenie penicyliny i streptomycyny. Komórki BJAB transfekowano przez elektroporację (250 V, 950 mikrofaradów) 20 .g plazmidowego DNA do 107 komórek w 0,5 ml pożywki pozbawionej surowicy. Komórki następnie przeniesiono do pełnej RPMI, którą wstępnie inkubowano do 37 ° C. Wydajność transfekcji komórek BJAB była rutynowo 30 ~ 50% w tych warunkach (36). Stabilne komórki BJAB i HepG2 eksprymujące białka MIR wytworzono przez transdukcję retrowirusową. Po transfekcji wektorami retrowirusowymi (pBMN lub pBMP, zawierającymi oporność na neomycynę lub oporność na puromycynę), linia komórek pakujących Phoenix wytwarza cząsteczki wirusowe z defektem replikacji, które były stosowane do stabilnej transdukcji komórek HepG2 lub BJAB biorcy. Przejściowe transfekcje komórek Phoenix przeprowadzono przy użyciu Fugene6 (Roche Applied Science) zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem. Komórki Phoenix transfekowano, pożywkę zmieniono 24 godziny po transfekcji, a supernatant zawierający wirusa zebrano 48 godzin po transfekcji, przesączono przez filtr strzykawkowy 0,45 .m i rozcieńczono za pomocą Polybrene (końcowe rozcieńczenie, 4 .g / ml) . Komórki HepG2 i BJAB infekowano wirusem (800 g przez 2 godziny w temperaturze 22 ° C) przy użyciu 2 ml supernatantu wirusa na studzienkę 6-studzienkowej płytki. Selekcję stransdukowanego HepG2 lub BJAB rozpoczęto 36 godzin po zakażeniu, dodając odpowiednio 1,5 mg / ml i 0,8 mg / ml G418 do komórek BJAB i HepG2, lub 1. G / ml puromycyny do komórek BJAB.
[podobne: olx solec kujawski, łupież tłusty, miód rzepakowy właściwości ]