ortopedia jasło

Następnie komórki inkubowano dalej z mieszaniną skoniugowanego z PE mysiego receptora antyfedrynowego (Caltag Laboratories) i mysiego anty-CD1d (Clone NOR3.2; Calbiochem, EMD Biosciences) znakowanego przez Zenon Allophycocyanin Mouse IgG1 Labelling Kit (Zenon-1). APC, Invitrogen Corp.) w 100 ul PBS plus 1% BSA. Po tej ostatniej inkubacji komórki przemyto intensywnie PBS i zawieszono w 200 ul PBS do analizy za pomocą systemu cytometrii przepływowej FACScalibur (BD Biosciences). Dla eksperymentów BJAB i HepG2 komórki płukano raz PBS plus 1% BSA i inkubowano bez wiązania z odpowiednim przeciwciałem na lodzie. CD1d analizowano za pomocą mysiego przeciwciała anty-CD1d (Clone NOR3.2; Calbiochem, EMD Biosciences), który znakowano Zenon-1 (APC (Invitrogen Corp.). Pozakomórkową mysią CD1d analizowano przez pochodzące od szczurów przeciwciało anty-mysie CD1d (rozcieńczenie Clone 1B1, 1: 100, BD Biosciences . Pharmingen) z kozim anty-szczurzym drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z allofikocyjaniną (rozcieńczenie 1: 100; Caltag Laboratories) . Ponadto, w tych doświadczeniach użyto mysiej anty-ludzkiej MHC klasy I (klon W6 / 32) wstępnie przyłączonej do PE (Caltag Laboratories) w rozcieńczeniu 1: 100 w PBS plus 1% BSA. Po inkubacji i intensywnym przemywaniu w PBS, komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą systemu cytometrii przepływowej FACScalibur. Koimmunoprecypitacja i Western blotting. Stabilne komórki HepG2 lub 5 x 106 komórek BJAB zawartych w konfluentnej 10-cm naczynku przemyto 3 razy lodowato zimnym PBS i ml lodowatego PBS plus 1% Igepalu (detergent typu NP-40, Sigma-Aldrich). dodano do naczynia lub probówki. Komórki zawieszono w buforze do lizy i przepuszczono dwa razy przez strzykawkę 21-gauge, a lizat oczyszczono przez wirowanie w mikrowirówce przez 10 minut przy maksymalnej prędkości (13 000 g) w 4 ° C. Lizaty inkubowano z 2 .g mysiego przeciwciała anty-CD1d (klon 51.1.3, hojny dar S. Porcelli, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA) (46), który rozpoznał. -2 skompleksowanej postaci CD1d lub szczurzego anty-mysiego CD1d (Clone 1B1; BD Biosciences. Pharmingen). Po godzinie mieszania w 4 ° C dodano 20 ul białka A / G z perełkami agarozowymi (dla przeciwciała mysiego) lub kulki białka G (dla szczurzego przeciwciała, oba z Santa Cruz Biotechnology Inc.) w celu wymieszania z lizatem przez noc w 4 ° C. Perełki do immunoprecypitacji następnie przemyto 4 razy zimnym PBS i ponownie zawieszono w buforze obciążającym SDS. Immunoprecypitaty następnie rozdzielono za pomocą SDS-PAGE (żel gradientowy Tris-HCl o stężeniu 4% 20%, Bio-Rad Laboratories), a białka przeniesiono na nitrocelulozę (Immobolion-P; Millipore). Po zablokowaniu przez noc w TBS, Tween20 i 5% mleka, błonę inkubowano przez godzinę z mysim przeciwciałem przeciw ubikwitynie (N-19) (Santa Cruz Biotechnology Inc.) prekoniugowanym z HRP. Po intensywnym przemywaniu (3 razy przez 15 minut i 3 razy przez 5 minut) za pomocą TBS, Tween20 i 5% mleka, przeciwciała wizualizowano za pomocą Luminolu (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Eksperymenty dominujące i negatywne Dynamina. Komórki BJAB transfekowano 24 .g DNA w stosunku 3: 2: 1, składającym się z pCR3.1 eksprymującego chimeryczny CD1d typu dzikiego (Figura 5D), pustego lub eksprymującego MIR pCR3.1 i pIRES2-EGFP z albo allel typu dzikiego albo dominujący-ujemny (K44E) dynaminy (41). Konstrukty dynamin typu dzikiego i K44E były miłym prezentem dla RB Vallee (Worcester Foundation for Experimental Biology, Shrewsbury, Massachusetts, USA). Po 40 godzinach komórki zabarwiono, a poziomy powierzchni chimerycznego CD1d zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki wyrażające EGFP bramkowano i analizowano poziomy chimerycznej CD1d. Analiza impulsów. Stosowano komórki HepG2 (6 cm na pół punktu), które były stabilne dla ekspresji MIR2 lub lacZ jako kontroli.
[podobne: młody zielony jęczmień gdzie kupić, olx solec kujawski, misy tybetańskie ]