Rola p53 w różnicowaniu komórek nabłonka końcowego

W związku z tym zbadaliśmy, czy promotory RFG są regulowane przez egzogenny p53 typu dzikiego przy użyciu linii komórek moczowodu pozyskanej z embrionalnej nerki myszy (komórki UB). Komórki UB przejściowo transfekowano konstruktami promotor-reporter dla szczurzego B2R (konstrukt o masie cząsteczkowej 1,2 kb / CAT), szczurzego AT1A (> 3,2 kb / lucyferaza), ludzkiego Na, K-ATPazy-a (<6,0 kb / CAT), lub mysie AQP-2 (<10,0 kb / CAT), wraz z wektorem ekspresyjnym p53 wywołanym promotorem pCMV. Figura 3, cc, pokazuje, że p53 silnie aktywuje promotory B2R, Na, K-ATPase-A i AQP-2. Bardziej umiarkowaną, ale znaczącą aktywację RFG za pośrednictwem p53 obserwowano również w komórkach HeLa, ludzkiej linii komórek raka szyjki macicy bez funkcjonalnego endogennego p53 (Figura 3, df). p53 nie aktywował szczurzego promotora AT1A (> 3,2 kb / CAT) w komórkach UB lub HeLa (dane nie przedstawione). Jednakże, jak pokazano poniżej, ekspresja DN p53 miała wpływ na represję endogennego mRNA AT1A i ekspresję białka, co sugeruje, że regulacja promotora AT1A przez p53 może wymagać dodatkowych czynników. Figura 3Exogenny p53 typu dzikiego transaktywuje promotory RFG. Komórki UB lub HeLa kotransfekowano 0, 10 lub 50 ng plazmidowego DNA pCMV-p53 i 1,2 | jg każdego z konstruktów promotor-reporter dla szczurzego B2R (a i d), mysiego AQP-2 (b i e), i ludzki Na, K-ATPase-P (c i f). pSV-lacZ (0,5 .g) kotransfekowano w celu pomiaru skuteczności transfekcji. Ekstrakty komórkowe zebrano 24 godziny po transfekcji i oznaczono aktywność CAT (procent acetylowania). Wyniki są średnie. SE trzech eksperymentów wykonanych w dwóch powtórzeniach. * P <0,001 względem 0 ng p53; # P <0,05 versus 10 ng p53. W celu dalszego zbadania regulacji RFG za pośrednictwem p53, ocenialiśmy efekty nadekspresji zmutowanej postaci DN p53, p53E258K, na aktywność promotora RFG w komórkach IMCD3. Promotory RFG, z wyjątkiem AQP-2, wykazują mierzalne podstawowe aktywności w tych komórkach. p53E258K koduje białko p53, które jest uszkodzone w wiązaniu DNA, ale zachowuje swoją zdolność do oligomeryzacji i inaktywacji endogennego p53 typu dzikiego. Jak pokazano na Figurze 4a, nadekspresja DN p53 tłumiła podstawowe aktywności promotorów B2R, AT1A i Na, K-ATPase-Ai. Ponadto, półilościowy RT-PCR wykazał, że nadekspresja DN p53 przez przejściową transfekcję tłumiła ekspresję mRNA endogennego B2R, AT1A i Na, K-ATPazy-a w porównaniu z tym występującym w komórkach transfekowanych pSV-laacZ (Figura 4b) lub pusty wektor kontrolny pCMV (nie pokazano). Figura 4DN p53 hamuje ekspresję RFG i aktywność promotora. (a) Komórki IMCD3 kotransfekowano rosnącymi ilościami (0, 100 i 500 ng) plazmidu p53 p53 napędzanego promotorem wirusowym i ustaloną ilością (1,2 ug) B2R, AT1A i Na, K-ATPase-a. konstrukty promotor-reporter. Lizat komórkowy zebrano 24 godziny po transfekcji i testowano na aktywność CAT lub lucyferazy. (b) Reprezentatywne testy RT-PCR ekspresji mRNA RFG. Transfekcja komórek IMCD3 plazmidem DN p53 (1,0. G DNA) represjonuje endogenny B2R (zakres od 1,5 do 4-krotny, n = 3), Na, K-ATPase-P (2,5 do 4-krotnie, n = 3 ) i ekspresję mRNA AT1A (2- do 4-krotnego; n = 3) względem ekspresji w kontrolnych komórkach transfekowanych pSV-lacZ2. Transfekcja plazmidu pCMV-p53 (typu dzikiego) (1,0 .g DNA) aktywuje ekspresję mRNA B2R i Na, K-ATPase-a 1. Pełnowymiarowy szablon cDNA szczurzego B2R (ścieżka cDNA oznaczona jako ścieżka) zastosowano jako kontrolę pozytywną w reakcji amplifikacji PCR dla B2R. Ekspresja GAPDH nie miała wpływu na typ dziki lub DN p53. (c. e) Wpływ DN p53 na ekspresję endogennego RFG ocenianą metodą analizy Western blot przy użyciu przeciwciał B2R (c), AT1A (d) i Na, K-ATPase-A (e). Wydajność transfekcji w tych eksperymentach mieściła się w zakresie od 30% do 40%. Western blot z PAb240 wykazuje dowody nadekspresji ludzkiej DN p53 [hasła pokrewne: narośl na skórze, napięciowe bóle głowy, miód rzepakowy właściwości ]