szczecin zdunowo szpital adres

Jak pokazano, tylko w obecności MIR2 ubikwitynowane białka koimmunoprecypitowały z CD1d. MIR2 indukuje obniżenie poziomu CD1d, a ubikwitynacja CD1d zależy od lizyny śródplazmatycznej. Ogon śródcytoplazmatyczny CD1d zawiera pojedynczą lizynę, która może być celem ligaz ubikwitynowych MIR (Figura 5A). W poprzednim badaniu, usunięcie lizyny z ogniska cytoplazmatycznego potencjalnych celów regulacji w dół MIR zniosło ubikwitynację docelowych białek i ich późniejszą regulację w dół (32). Co ciekawe, mysie CD1d nie ma lizyn cytozolowych i nie jest obniżone przez MIR2 w komórkach mysich lub nawet gdy ulega ekspresji w komórkach ludzkich CD1d-dodatnich (patrz Suplementowa Figura 1, dostępne w Internecie z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI200524041DS1). Dodanie lizyny do cytoplazmatycznego końca mysiego CD1d również czyni ją podatną na regulację w dół za pośrednictwem MIR i zwiększa ubikwitynację (Suplemental Figura 1). Dlatego też, w celu zbadania roli jedynej lizyny w cytoplazmatycznym ogonie ludzkiego CD1d, lizynę zmutowano do argininy (Figura 5A). Aby umożliwić specyficzne wykrywanie transfekowanych cząsteczek CD1d w ludzkich komórkach BJAB, wytworzono chimeryczne białka CD1d, które zawierają zewnątrzkomórkowe domeny mysiego CD1d połączonego z regionem przezbłonowym i cytoplazmatycznym ogonem ludzkiego CD1d (Figura 5B). Ludzka domena transbłonowa CD1d została zachowana w chimerze, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że białka MIR wykorzystują region transbłonowy jako miejsce dla swoistości docelowej (32, 36). Chimery te mogą być specyficznie wykrywane za pomocą mAb anty-mysiego CD1d, który nie reaguje krzyżowo z ludzkim CD1d. Jak pokazano na Figurze 5C, przejściowa kotransfekcja wektora ekspresyjnego EGFP i tych chimerycznych konstruktów CD1d w komórkach BJAB dała ekwiwalentną ekspresję powierzchniową zarówno chimerycznych cząsteczek CD1d typu dzikiego jak i zmutowanej lizyny do argininy (Figura 5C). Gdy te konstrukty kotransfekowano wektorem ekspresyjnym funkcjonalnego białka fuzyjnego MIR2-EGFP, uzyskano jednak wyraźnie inny wynik. Podczas gdy chimera typu dzikiego była silnie obniżona przez MIR2, efekt ten został zniesiony przez mutację lizyna-do-argininy (Figura 5C). Figura 5CD1d lizyny cytoplazmatycznej są wymagane do regulacji MIR2 i ubikwitynacji CD1d. (A) Wyrównanie i organizację ogonów transbłonowych i cytoplazmatycznych ludzkiego CD1d dzikiego typu i mutanta lizyna-arginina. (B) Wytworzono kilka białek chimerycznych w celu potwierdzenia zapotrzebowania na lizyny cytoplazmatyczne do obniżenia poziomu CD1d przez białka MIR. Ten schemat pokazuje teoretyczną organizację domen chimerycznych cząsteczek CD1d, które zostały zbudowane i wprowadzone mutacje. (C) Komórki BJAB kotransfekowano jedną z dwóch chimerycznych cząsteczek CD1d (mutant typu dzikiego lub lizyna-arginina) z wektorem ekspresyjnym dla EGFP (lewy panel) lub MIR2 połączonym z EGFP (prawy panel). Poziomy chimerycznego CD1d określono przez barwienie przeciwciałami przeciw myszy CD1d, a komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, z bramkowaniem na komórki pozytywne pod względem EGFP. (D) Komórki BJAB były trwale transdukowane lacZ (jako kontrola) lub MIR2, a następnie stabilnie transdukowane albo chimerycznym CD1d typu dzikiego albo mutacją lizyna-arginina. Komórki następnie poddano lizie, chimeryczne mysie CD1d (mCD1d) poddano immunoprecypitacji, a immunoprecypitat został zmiażdżony na obecność ubikwityny. Aby potwierdzić, że rola lizyny ma służyć jako substrat ubikwitynacyjny, komórki BJAB trwale wyrażające lacZ lub MIR2 były następnie stabilnie transdukowane chimerycznym CD1d typu dzikiego lub lizyny do argininy. Z każdej z 4 otrzymanych linii, chimeryczne łańcuchy CD1d poddano immunoprecypitacji mysim anty-CD1d, a po przeprowadzeniu SDS-PAGE i elektroblottingu do membran, bloty sondowano przeciwciałem przeciw ubikwitynie sprzężonym z HRP.
[więcej w: mefedron cena, nefropatia cukrzycowa, olx ostrowiec sw ]