usuwanie kamienia nazębnego metody

Aktywność biotyna-dyzy mierzono metodą Wolfa i in. (10). Aktywności trzech zależnych od biotyny karboksylaz oznaczono w ekstraktach zarówno PBMC jak i hodowanych fibroblastów skóry przez Laboratorium Biochemicznej Służby Genetyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego (San Diego, Kalifornia, USA), stosując testy inkorporacji 14CO2 (11, 12). ). Testy przeprowadzono na komórkach hodowanych w minimalnych niezbędnych pożywkach Eagle a zawierających 10% FCS; zawartość biotyny w mediach zwykle wynosi 6 nmoli / l. Testy enzymatyczne przeprowadzono w buforach bez dodanej biotyny. Izolacja PBMC i erytrocytów. PBMC, które są głównie limfocytami (13) i erytrocyty izolowano z heparynizowanej krwi żylnej przez wirowanie w gradiencie przy użyciu Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), jak opisano poprzednio (14). Po wysłaniu próbek krwi probanda i jego rodziców do University of Arkansas for Medical Sciences (Little Rock, Arkansas, USA), żywotność limfocytów pozostała większa niż 97% przez wykluczenie błękitem trypanowym (14). Transport biotyny i kwasu pantotenowego w PBMC i erytrocytach. Transport biotyny i kwasu pantotenowego mierzono odpowiednio za pomocą [3H] biotyny i kwasu [3H] pantotenowego, jak opisano wcześniej (14, 15). Sekwencjonowanie genu biotynidazy. DNA wyizolowano z krwi obwodowej. Egonowe i sąsiadujące intronowe regiony genu były bezpośrednio sekwencjonowane, jak opisano wcześniej (2). Sekwencjonowanie zależnego od sodu genu transportera multiwitaminy. Jak opisano wcześniej (15), całkowite RNA wyizolowano z krwi obwodowej, a cDNA dla zależnego od sodu genu transportera multiwitaminy (SMVT) wyizolowano za pomocą RT-PCR, stosując spersonalizowane startery oligonukleotydowe. Wytworzony cDNA sklonowano i zsekwencjonowano, jak opisano wcześniej (15). Dla każdego fragmentu sekwencjonowano jeden lub dwa klony. Każdy fragment został zsekwencjonowany co najmniej jeden raz z każdego kierunku. Wirus Epsteina Barra transformacja PBMC. PBMC unieśmiertelniono stosując metodę EBV (16). Osoby normalnie kontrolujące dostarczające komórek do transformacji nie były tymi samymi osobami, które dostarczyły krew do pomiaru wychwytu biotyny w spokojnych PBMC. Wyniki Wycofanie biotyny. Oceniliśmy, czy konieczne jest kontynuowanie leczenia biotyną przez dwukrotne wycofanie terapii biotyną, jak opisano w Metodach. Podczas żadnej z prób nie wystąpiły jawne objawy lub objawy. Suplementację biotyną przywrócono przy 10 mg / d (41 .Mol / d), gdy nieprawidłowo zwiększone wydalanie 3HIA wykryto za pomocą stosunkowo niewrażliwej standardowej metody (6). Końcowe oznaczenie ilościowe za pomocą zoptymalizowanej metody oznaczania ilościowego 3HIA wykazało utrzymujące się nieprawidłowe wydalanie 3HIA nawet przed odstawieniem biotyny (Figura 1). W trzecim tygodniu odstawienia, wydalanie 3HIA wzrosło dziesięciokrotnie. Podczas drugiej próby wycofania, wydalanie 3HIA było podobne do pierwszego (ryc. 1). Obydwie próby dostarczyły dowodów na utrzymujący się i postępujący spadek aktywności karboksylazy metylokarbonylo-CoA. Figura 1Uwzględne wydalanie 3HIA podczas odstawiania biotyny. Białe kółka oznaczają próbę numer 1, a czarne kółka oznaczają próbę numer 2. W terapii biotyną wydalanie 3HPA było początkowo normalne. W trzecim tygodniu odstawienia wydalanie 3HPA wzrosło do ponad dwukrotności górnej granicy normy, dając dowód na zmniejszoną aktywność karboksylazy propionylo-CoA. Podobny wzorzec zaobserwowano podczas drugiej próby wycofania biotyny. Częstość wydalania z moczem 3-metylobrotonylo-glicyny, izowalerylogliceryny i cytrynianu metylu była prawidłowa podczas obu prób wycofania. Aktywność enzymu. Aktywności trzech intracitochondrialnych karboksylazy zależnych od biotyny były normalne zarówno w leukocytach, jak i fibroblastach od dziecka, wykluczając w ten sposób wyizolowane niedobory tych enzymów jako przyczyny jego zależności od biotyny (Tabela 2, normalny zakres od Biochemical Genetics, University of California. San Diego , San Diego, Kalifornia, USA)
[podobne: mastocytoza, mefedron cena, młody zielony jęczmień gdzie kupić ]