Zakażenie Wirusowe zapalenie wątroby typu B u pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby typu C wątroby cd

U 28 spośród tych pacjentów (7, którzy byli anty-HBc-dodatni i 21, którzy byli anty-HBc-ujemni) terapię uznano za udaną, ponieważ mieli normalne wyniki w testach funkcji wątroby i nie mieli wykrywalnego RNA HCV co najmniej sześć miesięcy po zakończeniu terapii. Protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu w Messynie, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
Analizy DNA HBV
DNA ekstrahowano z zamrożonej próbki wątroby każdego pacjenta za pomocą standardowych procedur.19 Wszystkie ekstrakty DNA z wątroby analizowano pod kątem genomów HBV za pomocą dwóch różnych testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu wykrycia genów S i rdzenia, zgodnie z wcześniej opisanymi metodami. W skrócie, 100 .l mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 .l ekstrahowanego DNA, 50 mM chlorek potasu, 10 mM TRIS kwas solny (pH 8,3), 2 mM chlorek magnezu, 200 .M deoksyrybonukleozydy, 2,5 U polimerazy Taq (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) I 20 pmol każdego ze starterów oligonukleotydowych HBV1 i HBV2 dla genu S i starterów HBV3 i HBV4 dla genu rdzenia nałożono 100 .l oleju mineralnego. Amplifikację prowadzono przez 35 cykli, z których każdy składał się z denaturacji przez 30 sekund w 94 ° C, hybrydyzacji przez 45 sekund w 56 ° C i wydłużania przez 1,5 minuty w 72 ° C. Produkty amplifikacji wizualizowano w 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Gdy nie zaobserwowano żadnego produktu amplifikacji na żelu, przeprowadzono drugą rundę zagnieżdżonej amplifikacji PCR z 10 .l z produktu z pierwszej reakcji i wewnętrznymi starterami HBV5 i HBV6 dla regionu S i HBV7 i HBV8 dla regionu rdzenia.
Pacjenci, u których stwierdzono dodatni tylko jeden z dwóch badanych regionów, byli ponownie testowani jednoetapowymi lub zagnieżdżonymi procedurami PCR z użyciem zestawów starterów oligonukleotydowych (HBV9 i HBV10 oraz HBV11 i HBV12) obejmujących wirusowy gen X. Zostały one uznane za zdecydowanie zakażone lub niezakażone HBV, zgodnie z wynikami tego dodatkowego testu. Zastosowane startery były komplementarne do konserwatywnych regionów genotypu HBV D w następujących pozycjach (od 5 do 3 ): HBV1, 61-81; HBV2, 1004-985; HBV3, 1778-1800; HBV4, 2483-2464; HBV5, 154-174; HBV6, 839-819; HBV7, 1928-1946; HBV8, 2391-2372; HBV9, 968-986; HBV10, 1951-1931; HBV 11, 1266-1283; i HBV12, 1804-1784. Granice czułości naszych jednoetapowych i zagnieżdżonych metod PCR wynosiły odpowiednio x 10-3 pg i x 10-6 pg sklonowanego DNA HBV. Bezpośrednie sekwencjonowanie losowo wybranych produktów amplifikacji wykazało różne sekwencje między pacjentami, co potwierdziło specyficzność reakcji
DNA ekstrahowano również z próbek surowicy od wszystkich pacjentów z wewnątrzwątrobowymi genomami HBV i od 35 dodatkowych pacjentów losowo wybranych spośród tych, którzy byli ujemni na wewnątrzwątrobowe wirusowe DNA. Cały gen S wirusa HBV wyizolowany od trzech pacjentów z zakażeniem okultystycznym, którzy zostali losowo wybrani z grupy HCV-pozytywnej, amplifikowano za pomocą dwóch hybrydowych starterów oligonukleotydowych, klonowano do wektora pUC19 i sekwencjonowano według wcześniej opisanych procedur. Dalsze badania na tych pacjentach obejmowały bezpośrednie sekwencjonowanie całego genu rdzenia izolatów HBV i testowanie HBsAg i antygenu rdzeniowego B (HBcAg) w skrawkach wątroby metodami immunohistochemicznymi.19 Trzech pacjentów, którzy byli dodatni pod względem HBsAg pięć do ośmiu lat przed to badanie miało utajone zakażenie HBV
[przypisy: chloramfenikol, nutrend, polyporus ]
[podobne: migotanie przedsionków leczenie, miód rzepakowy właściwości, misy tybetańskie ]